Cette étude a porté sur des patients adultes (≥ 18 ans) sous TARV depuis au moins 6 mois, suivis dans le cadre du programme national. Les patients inclus dans cette étude ont été recrutés consécutivement sur la période allant de septembre à octobre 2010 au niveau de 4 sites de prise en charge (PEC). Les individus infectés par le VIH-2 ou coinfectés par le VIH-1 et VIH-2, de même que les femmes ayant bénéficiés d’une prévention de la transmission mère-enfant du VIH (PTME), n’étaient pas inclus. Le choix de ces sites a été fait de façon aléatoire et sur la base de l’existence d’association de personnes vivant avec le VIH pouvant faciliter la collecte des échantillons. Un des sites est situé dans la capitale, le Centre de Traitement Ambulatoire de Conakry, et les 3 autres sont localisés dans les régions de Boké, Mamou et Labé, distants respectivement de 300, 350 et 600 km de la capitale (Figure 1).

Pour chaque patient, 5 mL de sang total ont été recueillis dans un tube EDTA par ponction veineuse au niveau du pli du coude pour servir à la préparation de 2 cartes de papier filtre Whatman 903^®, conformément aux règles d’hygiène et de sécurité , et 50 µL de sang total ont été déposés sur chacun des 5 spots à raison d’une carte DBS, préalablement identifiée et datée. Les échantillons ont été séchés pendant la nuit à température ambiante (30 à 37 °C). Chaque échantillon DBS a été placé dans un sachet plastique individuel hermétiquement fermé en présence de dessiccateurs. Puis, ils ont été conservés et stockés sur site à température ambiante. L’envoi des DBS vers le laboratoire de Bactériologie Virologie de l’Hôpital Aristide Le Dantec de Dakar au Sénégal pour les tests de CV et de génotypage s’est fait par voie terrestre dans les 30 jours suivant le prélèvement.

A partir de 2 spots de chaque échantillon DBS/patients et à l’aide de l’appareil NucliSENS miniMAG (bioMérieux, Craponne, France), les acides nucléiques totaux ont été obtenus par extraction magnétique et manuelle selon la chimie de Boom.¹⁴ En effet, les spots découpés à l’aide d’un « puncher » dédié ont été trempés dans un tube contenant 2 mL de tampon de lyse et agité pendant 30 minutes à température ambiante. Les acides nucléiques ont été extraits et élués dans 25 µL de tampon d’élution après une série de centrifugation et des lavages avec des tampons 1, 2 et 3 comme précédemment décrit.¹⁰

La détermination de la CV a été effectuée à partir de l’extrait obtenu et ceci en utilisant kit NucliSENS EasyQ HIV-1 v2.0 (bioMérieux, Craponne,France) conformément aux instructions du fabriquant. La plateforme utilisée était NucliSENS® EasyQ (BioMérieux, Lyon, France) et le principe est une amplification de type NASBA. Le seuil de détectabilité de la technique est de 800 copies/mL.15 Dans cette présente étude, le seuil de l’échec virologique a été fixé à 3 log₁₀ copies/mL

Le génotypage a été effectué selon le protocole de l’ANRS (http://www.hivfrenchresistance.org/) qui consiste à faire des amplifications séparées par PCR des fragments de la protéase en entier et des 240 premiers codons de la reverse transcriptase (RT) du gène pol en utilisant respectivement les couples d’amorces 5’Prot1/3’Prot1 et MJ3/MJ4 comme amorces externes et 5’Prot2/3’Prot2 et A35/NE35 comme amorces internes. Les produits de PCR de 2^ème tour ont été purifiés avec le kit QIAquick Gel Extraction Kit®, (Qiagen, Courtaboeuf, France) conformément aux indications du fabriquant. L’ADN purifié a été directement séquencé sur la plateforme ABI Prism 3100 Avant (Genetic analyzer Applied Biosystem) selon la technologie du Big Dye Terminator Technology®v3.1 (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France). Les séquences obtenues ont été assemblées et manuellement éditées sur le logiciel SeqManTM II 5.08 de la suite de DNAstar® software (Lasergene, Konstanz, Germany). L’analyse et l’interprétation des mutations de résistance ont été réalisées sur l’algorithme de l’Université de Stanford version 6.0.8 (http://hivdb.stanford.edu/). Les séquences générées ont été alignées avec des séquences références du VIH-1 groupe M et l’ensemble des formes recombinant les CRFs disponibles sur Los Alamos hiv database (http://www.hiv.lanl.gov/content/index). Trois séquences de chaque sous-type pur ont été incluses dans l’alignement. Et les séquences ont été alignées avec l’algorithme de MUSCLE puis l’alignement dégapé obtenu a été avec le programme de Gblocks du logiciel SEAVIEW v4.4.1. L’arbre phylogénétique de Maximun de vraisemblance (PhyML) a été également généré sur SEAVIEW v4.4.1 avec comme paramètres supports de branche déterminés par la méthode approximate likelihood ratio test (aLRT), option SH-like. L’analyse de similarité et de bootscanning pour la confirmation des formes recombinantes (CRFs, URFs) a été effectuée sur le logiciel Simplot v3.5.1.^16,17 L’analyse et les calculs statistiques des données ont été réalisés avec les logiciels Epi Info v3.5.4 et Microsoft Excel.

Au total 136 patients infectés par le VIH-1 sous TARV ont participé à cette étude. Parmi eux, 129 étaient sous traitement de première ligne (2INTI + 1INNRT) et 7 sous deuxième ligne (2INTI + 1IP/r), avec une médiane de suivi thérapeutique de 35 mois [IQR: 6-108 mois]. Le sexe ratio Homme/Femme était de 0,64 et l’âge médian était de 38 ans [IQR: 18-61 ans] Boîte 1.

L’échec virologique (CV ≥ 3 log₁₀ copies/mL) a été observé chez 33 patients soit un taux de 24.26% (n = 33/136). Parmi eux, 4 étaient sous deuxième ligne de TARV et 13/29 patients ont eu des changements de molécules de première ligne (exemple: d4T par AZT) pour des raisons cliniques ou de tolérance. Dans le Tableau 1, figurent entre autre l’historique du traitement et les données virologiques des patients en échec virologique. Selon la durée du traitement, 4/13, 7/31 et 22/92 patients étaient en échec virologiques respectivement à des intervalles 6-12, 13-24 et > 24 mois.

Au total, 28/33 échantillons de patients en échec virologique ont pu être génotypés soit un taux d’amplification réussi de 84.84%. La médiane de CV de ces échantillons de patients en échec virologique génotypés (n = 28) était de 4 log₁₀ copies/mL [IQR: 3-6.7] et celui des échantillons non amplifiés (n = 5) était de 3.1 log₁₀ copies/mL [IQR: 3-3.6] pour une p-value = 0.02. Au moins une mutation conférant une résistance à une molécule antirétrovirale a été observée chez 19 patients, soit un taux de résistance globale de 14%. La mutation M184V (n = 13) et les TAMs (Thymidine Analogue-Associated Mutations) (n = 32) étaient les plus fréquemment observées pour les INTI et la K103N (n = 11) et Y181C (n = 7) pour les INNTI. Leurs survenues étaient d’autant plus marquées que la durée du traitement était élevée (Figure 2). L’insertion T69 a également été observée chez 5 patients dont un en deuxième ligne. D’autres mutations comme la V198I, G190A/G et Y188A/L ont été également notées chez 4, 3 et 2 patients respectivement (Tableau 1). Par ailleurs, aucune mutation de résistance majeure aux IP (Inhibiteur de Protéase) n’a été observée et ceci qu’il s’agisse de patients avec une virémie supérieure à 3 log₁₀ copies/mL ou pas, de patients sous première ligne ou deuxième ligne de traitement.

L’analyse phylogénétique des séquences nucléotides a permis de montrer la prédominance du CRF02_AG, 82% (n = 23/28). Les sous types D et CRF06_cpx ont été observés dans les proportions respectives 7% (n = 2/28) et 11% (n = 3/28) (Figure 3).